В вашем браузере в данный момент отключен JavaScript. При отключении JavaScript некоторые функции этого веб-сайта работать не будут.
Зарегистрируйте свои данные и интересующие вас лекарственные препараты, и мы сопоставим предоставленную вами информацию со статьями в нашей обширной базе данных и оперативно отправим вам PDF-копию по электронной почте.
Контролируемое перемещение магнитных наночастиц оксида железа для адресной доставки цитостатиков.
Автор Торопова Ю, Королев Д, Истомина М, Шульмейстер Г, Петухов А, Мишанин В, Горшков А, Подъячева Е, Гареев К, Багров А, Демидов О
Яна Торопова,1 Дмитрий Королев,1 Мария Истомина,1,2 Галина Шульмейстер,1 Алексей Петухов,1,3 Владимир Мишанин,1 Андрей Горшков,4 Екатерина Подячева,1 Камиль Гареев,2 Алексей Багров,5 Олег Демидов6,71 Национальный медицинский научно-исследовательский центр им. А. Алмазова Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург, 197341, Российская Федерация; 2 Санкт-Петербургский электротехнический университет «ЛЕТИ», Санкт-Петербург, 197376, Российская Федерация; 3 Центр персонализированной медицины, Государственный медицинский научно-исследовательский центр им. А. Алмазова Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург, 197341, Российская Федерация; 4 ФГБИ «Научно-исследовательский институт гриппа им. А. А. Смородинцева» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург, Российская Федерация; 5 Институт эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова Российской академии наук, Санкт-Петербург, Российская Федерация; 6 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, 194064, Российская Федерация; 7ИНСЕРМ U1231, Медицинский и фармацевтический факультет, Университет Бургундии-Франш-Конте, Дижон, Франция. Контактное лицо: Яна Торопова-Алмазов Национальный медицинский исследовательский центр, Министерство здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург, 197341, Российская Федерация. Тел.: +7 981 95264800 4997069. Эл. почта: [email protected] Введение: Перспективным подходом к проблеме цитостатической токсичности является использование магнитных наночастиц (МНП) для адресной доставки лекарственных средств. Цель: С помощью расчетов определить оптимальные характеристики магнитного поля, управляющего МНП in vivo, и оценить эффективность магнетронной доставки МНП к опухолям мышей in vitro и in vivo. Используется (МНП-ИКГ). Исследования интенсивности люминесценции in vivo проводились на мышах с опухолями, с магнитным полем в интересующем участке и без него. Эти исследования проводились на гидродинамическом каркасе, разработанном Институтом экспериментальной медицины Государственного медицинского исследовательского центра им. Алмазова Министерства здравоохранения Российской Федерации. Результат: Использование неодимовых магнитов способствовало селективному накоплению МНП. Через одну минуту после введения МНП-ИКГ мышам с опухолями МНП-ИКГ в основном накапливаются в печени. Это указывает на их метаболический путь как в отсутствие, так и в присутствии магнитного поля. Хотя в присутствии магнитного поля наблюдалось увеличение флуоресценции в опухоли, интенсивность флуоресценции в печени животного со временем не изменялась. Вывод: Этот тип МНП в сочетании с рассчитанной напряженностью магнитного поля может стать основой для разработки магнитно-контролируемой доставки цитостатических препаратов в опухолевые ткани. Ключевые слова: флуоресцентный анализ, индоцианин, наночастицы оксида железа, магнетронная доставка цитостатиков, таргетная терапия опухолей.
Опухолевые заболевания являются одной из основных причин смерти во всем мире. При этом сохраняется динамика роста заболеваемости и смертности от опухолевых заболеваний.¹ Химиотерапия, используемая сегодня, по-прежнему остается одним из основных методов лечения различных опухолей. В то же время разработка методов снижения системной токсичности цитостатиков остается актуальной. Перспективным методом решения проблемы токсичности является использование наноразмерных носителей для адресной доставки лекарственных средств, что позволяет обеспечить локальное накопление препаратов в опухолевых тканях без увеличения их концентрации в здоровых органах и тканях.² Этот метод позволяет повысить эффективность и адресность химиотерапевтических препаратов в опухолевых тканях, одновременно снижая их системную токсичность.
Среди различных наночастиц, рассматриваемых для адресной доставки цитостатических препаратов, особый интерес представляют магнитные наночастицы (МНП) благодаря их уникальным химическим, биологическим и магнитным свойствам, обеспечивающим их универсальность. Поэтому магнитные наночастицы могут использоваться в качестве системы нагрева для лечения опухолей с помощью гипертермии (магнитная гипертермия). Они также могут применяться в качестве диагностических агентов (магнитно-резонансная диагностика). 3-5 Использование этих характеристик в сочетании с возможностью накопления МНП в определенной области с помощью внешнего магнитного поля открывает возможности для создания многофункциональной магнетронной системы для адресной доставки цитостатиков к месту локализации опухоли. Такая система будет включать МНП и магнитные поля для контроля их движения в организме. В этом случае в качестве источника магнитного поля могут использоваться как внешние магнитные поля, так и магнитные имплантаты, размещенные в области тела, содержащей опухоль. 6 Первый метод имеет серьезные недостатки, включая необходимость использования специализированного оборудования для магнитной адресной доставки лекарств и необходимость обучения персонала для проведения хирургических операций. Кроме того, этот метод ограничен высокой стоимостью и подходит только для «поверхностных» опухолей, расположенных близко к поверхности тела. Альтернативный метод использования магнитных имплантатов расширяет область применения этой технологии, облегчая ее использование при опухолях, расположенных в разных частях тела. В качестве имплантатов для повреждения опухолей в полых органах и обеспечения их проходимости могут использоваться как отдельные магниты, так и магниты, интегрированные во внутрипросветный стент. Однако, согласно нашим собственным неопубликованным исследованиям, они недостаточно магнитны, чтобы обеспечить удержание магнитных наночастиц из кровотока.
Эффективность доставки лекарственных препаратов с помощью магнетрона зависит от многих факторов: характеристик самого магнитного носителя и характеристик источника магнитного поля (включая геометрические параметры постоянных магнитов и силу создаваемого ими магнитного поля). Разработка успешной технологии доставки ингибиторов клеток с помощью магнитного управления должна включать разработку соответствующих магнитных наноразмерных носителей лекарственных препаратов, оценку их безопасности и разработку протокола визуализации, позволяющего отслеживать их перемещение в организме.
В данном исследовании мы математически рассчитали оптимальные характеристики магнитного поля для управления магнитными наночастицами-носителями лекарственных препаратов в организме. Также была изучена возможность удержания магнитных наночастиц через стенку кровеносного сосуда под воздействием приложенного магнитного поля с использованием этих вычислительных характеристик на изолированных кровеносных сосудах крыс. Кроме того, мы синтезировали конъюгаты магнитных наночастиц и флуоресцентных агентов и разработали протокол для их визуализации in vivo. В условиях in vivo на мышах с опухолевой моделью изучалась эффективность накопления магнитных наночастиц в опухолевых тканях при системном введении под воздействием магнитного поля.
В исследовании in vitro мы использовали эталонные МНП, а в исследовании in vivo — МНП, покрытые полиэфиром молочной кислоты (PLA), содержащим флуоресцентный агент (индолецианин; ICG). В данном случае используются МНП-ICG (MNP-PLA-EDA-ICG).
Синтез, а также физико-химические свойства МНП подробно описаны в других источниках. 7,8
Для синтеза MNPs-ICG сначала были получены конъюгаты PLA-ICG. Использовалась порошковая рацемическая смесь PLA-D и PLA-L с молекулярной массой 60 кДа.
Поскольку PLA и ICG являются кислотами, для синтеза конъюгатов PLA-ICG необходимо сначала синтезировать аминоконцевой спейсер на PLA, который способствует хемосорбции ICG на спейсере. Спейсер был синтезирован с использованием этилендиамина (EDA), карбодиимидного метода и водорастворимого карбодиимида, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDAC). Синтез спейсера PLA-EDA проводился следующим образом: к 2 мл 0,1 г/мл раствора PLA в хлороформе добавляли 20-кратный молярный избыток EDA и 20-кратный молярный избыток EDAC. Синтез проводили в 15-мл полипропиленовой пробирке на шейкере со скоростью 300 мин⁻¹ в течение 2 часов. Схема синтеза показана на рисунке 1. Для оптимизации схемы синтеза повторяли синтез с 200-кратным избытком реагентов.
По завершении синтеза раствор центрифугировали со скоростью 3000 мин⁻¹ в течение 5 минут для удаления избытка осажденных производных полиэтилена. Затем к 2 мл раствора добавляли 2 мл раствора ICG концентрацией 0,5 мг/мл в диметилсульфоксиде (ДМСО). Мешалку устанавливали на скорость перемешивания 300 мин⁻¹ в течение 2 часов. Схематическое изображение полученного конъюгата показано на рисунке 2.
В 200 мг МНП добавили 4 мл конъюгата PLA-EDA-ICG. Суспензию перемешивали на шейкере LS-220 (ЛОИП, Россия) в течение 30 минут с частотой 300 мин⁻¹. Затем ее трижды промыли изопропанолом и подвергли магнитной сепарации. С помощью ультразвукового диспергатора УЗД-2 (ФГУП НИИ ТВЧ, Россия) изопропиловый спирт (ИПА) добавляли в суспензию в течение 5-10 минут при непрерывном ультразвуковом воздействии. После третьей промывки ИПА осадок промыли дистиллированной водой и ресуспендировали в физиологическом растворе в концентрации 2 мг/мл.
Для изучения распределения размеров полученных магнитных наночастиц в водном растворе использовалось оборудование ZetaSizer Ultra (Malvern Instruments, Великобритания). Форма и размер магнитных наночастиц изучались с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) с полевой эмиссионной катодной системой JEM-1400 STEM (JEOL, Япония).
В данном исследовании мы используем цилиндрические постоянные магниты (марка N35; с никелевым защитным покрытием) следующих стандартных размеров (длина длинной оси × диаметр цилиндра): 0,5×2 мм, 2×2 мм, 3×2 мм и 5×2 мм.
Исследование транспорта МНП in vitro в модельной системе проводилось на гидродинамическом каркасе, разработанном Институтом экспериментальной медицины Государственного медицинского исследовательского центра им. Алмазова Министерства здравоохранения Российской Федерации. Объем циркулирующей жидкости (дистиллированной воды или раствора Кребса-Хензеляйта) составляет 225 мл. В качестве постоянных магнитов используются аксиально намагниченные цилиндрические магниты. Магнит размещается на держателе на расстоянии 1,5 мм от внутренней стенки центральной стеклянной трубки, его концом в направлении трубки (вертикально). Расход жидкости в замкнутом контуре составляет 60 л/ч (что соответствует линейной скорости 0,225 м/с). В качестве циркулирующей жидкости используется раствор Кребса-Хензеляйта, поскольку он является аналогом плазмы. Коэффициент динамической вязкости плазмы составляет 1,1–1,3 мПа∙с.⁹ Количество МНП, адсорбированных в магнитном поле, определяется спектрофотометрически по концентрации железа в циркулирующей жидкости после эксперимента.
Кроме того, были проведены экспериментальные исследования на усовершенствованном стенде для моделирования гидродинамики с целью определения относительной проницаемости кровеносных сосудов. Основные компоненты гидродинамической опоры показаны на рисунке 3. Основными компонентами гидродинамического стента являются замкнутый контур, имитирующий поперечное сечение модели сосудистой системы, и резервуар для хранения. Перемещение модельной жидкости вдоль контура модуля кровеносного сосуда обеспечивается перистальтическим насосом. Во время эксперимента поддерживаются испарение и требуемый температурный диапазон, а также контролируются параметры системы (температура, давление, расход жидкости и значение pH).
Рисунок 3. Блок-схема установки, используемой для изучения проницаемости стенки сонной артерии. 1 – резервуар для хранения, 2 – перистальтический насос, 3 – механизм для введения суспензии, содержащей МНП, в контур, 4 – расходомер, 5 – датчик давления в контуре, 6 – теплообменник, 7 – камера с контейнером, 8 – источник магнитного поля, 9 – баллон с углеводородами.
Камера, содержащая контейнер, состоит из трех контейнеров: большого внешнего контейнера и двух малых контейнеров, через которые проходят ответвления центрального контура. Канюля вставляется в малый контейнер, контейнер натягивается на малый контейнер, а кончик канюли плотно обвязывается тонкой проволокой. Пространство между большим и малым контейнерами заполняется дистиллированной водой, и температура поддерживается постоянной благодаря соединению с теплообменником. Пространство в малом контейнере заполняется раствором Кребса-Хензеляйта для поддержания жизнеспособности клеток кровеносных сосудов. Резервуар также заполняется раствором Кребса-Хензеляйта. Система подачи газа (угля) используется для испарения раствора из малого контейнера в накопительном резервуаре и камере, содержащей контейнер (рис. 4).
Рисунок 4. Камера, в которой находится контейнер. 1 — Канюля для опускания кровеносных сосудов, 2 — Внешняя камера, 3 — Малая камера. Стрелкой указано направление движения моделируемой жидкости.
Для определения относительного индекса проницаемости стенки сосуда использовалась сонная артерия крысы.
Введение суспензии МНП (0,5 мл) в систему имеет следующие характеристики: общий внутренний объем резервуара и соединительной трубы в контуре составляет 20 мл, а внутренний объем каждой камеры — 120 мл. Внешним источником магнитного поля является постоянный магнит стандартного размера 2×3 мм. Он устанавливается над одной из малых камер, на расстоянии 1 см от контейнера, одним концом к стенке контейнера. Температура поддерживается на уровне 37 °C. Мощность роликового насоса установлена ​​на 50%, что соответствует скорости 17 см/с. В качестве контроля образцы отбирались в ячейке без постоянных магнитов.
Через час после введения заданной концентрации МНП из камеры отбирали образец жидкости. Концентрацию частиц измеряли с помощью спектрофотометра Unico 2802S UV-Vis (United Products & Instruments, США). С учетом спектра поглощения суспензии МНП измерение проводили при длине волны 450 нм.
В соответствии с рекомендациями Рус-ЛАСА-ФЕЛАСА, все животные выращиваются в условиях, свободных от специфических патогенов. Данное исследование соответствует всем соответствующим этическим нормам для экспериментов на животных и научных исследований и получило этическое одобрение Национального медицинского исследовательского центра им. Алмазова (ММУЦ). Животные получали воду в неограниченном количестве и кормились регулярно.
Исследование проводилось на 10 анестезированных 12-недельных самцах иммунодефицитных мышей NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Jackson Laboratory, США) весом 22 г ± 10%. Поскольку иммунитет у мышей с иммунодефицитом подавлен, мыши этой линии позволяют проводить трансплантацию человеческих клеток и тканей без отторжения трансплантата. Однопометники из разных клеток были случайным образом распределены в экспериментальную группу, и их разводили совместно или систематически подвергали воздействию подстилки других групп, чтобы обеспечить равное воздействие общей микробиоты.
Для создания ксенотрансплантационной модели использовалась линия клеток рака человека HeLa. Клетки культивировали в среде DMEM, содержащей глутамин (PanEco, Россия), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, США), 100 КОЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Линия клеток была любезно предоставлена ​​Лабораторией регуляции экспрессии генов Института клеточных исследований Российской академии наук. Перед инъекцией клетки HeLa удаляли с культурального пластика с помощью раствора трипсина и версена в соотношении 1:1 (Biolot, Россия). После промывания клетки суспендировали в полной культуральной среде до концентрации 5×10⁶ клеток на 200 мкл и разбавляли матрицей базальной мембраны (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, на льду). Приготовленную клеточную суспензию вводили подкожно в кожу бедра мыши. Для контроля роста опухоли каждые 3 дня используйте электронный штангенциркуль.
Когда размер опухоли достигал 500 мм³, в мышечную ткань экспериментального животного рядом с опухолью имплантировали постоянный магнит. В экспериментальной группе (MNPs-ICG + опухоль-M) вводили 0,1 мл суспензии MNP и подвергали воздействию магнитного поля. В качестве контроля использовали необработанных животных (фоновая группа). Кроме того, использовали животных, которым вводили 0,1 мл MNP, но не имплантировали магниты (MNPs-ICG + опухоль-BM).
Визуализация флуоресценции образцов in vivo и in vitro проводилась на биоимиджере IVIS Lumina LT серии III (PerkinElmer Inc., США). Для визуализации in vitro в лунки планшета добавляли 1 мл синтетического конъюгата PLA-EDA-ICG и MNP-PLA-EDA-ICG. С учетом флуоресцентных характеристик красителя ICG выбирали оптимальный фильтр для определения интенсивности свечения образца: максимальная длина волны возбуждения составляла 745 нм, а длина волны излучения — 815 нм. Для количественного измерения интенсивности флуоресценции в лунках, содержащих конъюгат, использовалось программное обеспечение Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.).
Интенсивность флуоресценции и накопление конъюгата MNP-PLA-EDA-ICG измеряли на мышах с моделью опухоли in vivo, без присутствия и применения магнитного поля в интересующем участке. Мышей анестезировали изофлураном, после чего 0,1 мл конъюгата MNP-PLA-EDA-ICG вводили внутривенно через хвостовую вену. Необработанных мышей использовали в качестве отрицательного контроля для получения фонового флуоресцентного сигнала. После внутривенного введения конъюгата животное помещали на нагревательную платформу (37°C) в камеру флуоресцентного томографа IVIS Lumina LT серии III (PerkinElmer Inc.), поддерживая ингаляцию с помощью 2% изофлурана. Для регистрации сигнала использовали встроенный фильтр ICG (745–815 нм) через 1 и 15 минут после введения MNP.
Для оценки накопления конъюгата в опухоли брюшинную область животного покрывали бумагой, что позволяло устранить яркую флуоресценцию, связанную с накоплением частиц в печени. После изучения биораспределения MNP-PLA-EDA-ICG животных гуманно эвтаназировали путем передозировки изофлурана для последующего разделения опухолевых участков и количественной оценки флуоресцентного излучения. Для ручной обработки сигнала из выбранной области интереса использовали программное обеспечение Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.). Для каждого животного проводили три измерения (n = 9).
В данном исследовании мы не проводили количественную оценку успешности загрузки ICG на MNPs-ICG. Кроме того, мы не сравнивали эффективность удержания наночастиц под воздействием постоянных магнитов различной формы. Также мы не оценивали долговременное влияние магнитного поля на удержание наночастиц в опухолевых тканях.
В суспензии преобладают наночастицы со средним размером 195,4 нм. Кроме того, суспензия содержала агломераты со средним размером 1176,0 нм (рис. 5А). Затем суспензию отфильтровали через центрифужный фильтр. Дзета-потенциал частиц составляет -15,69 мВ (рис. 5В).
Рисунок 5. Физические свойства суспензии: (A) распределение частиц по размерам; (B) распределение частиц при дзета-потенциале; (C) ТЭМ-фотография наночастиц.
Размер частиц составляет примерно 200 нм (рисунок 5C), они состоят из одной магнитной наночастицы размером 20 нм и органической оболочки, конъюгированной с PLA-EDA-ICG, с более низкой электронной плотностью. Образование агломератов в водных растворах можно объяснить относительно низким модулем электродвижущей силы отдельных наночастиц.
Для постоянных магнитов, когда намагниченность сосредоточена в объеме V, интегральное выражение делится на два интеграла, а именно объемный и поверхностного:
В случае образца с постоянной намагниченностью плотность тока равна нулю. Тогда выражение для вектора магнитной индукции примет следующий вид:
Для численных расчетов используйте программу MATLAB (MathWorks, Inc., США), академическая лицензия ЕТУ «ЛЕТИ» номер 40502181.
Как показано на рисунках 7, 8, 9 и 10, самое сильное магнитное поле генерируется магнитом, ориентированным аксиально относительно торца цилиндра. Эффективный радиус действия эквивалентен геометрии магнита. В цилиндрических магнитах с длиной цилиндра, превышающей его диаметр, самое сильное магнитное поле наблюдается в аксиально-радиальном направлении (для соответствующей компоненты); следовательно, наиболее эффективной является адсорбция МНП парой цилиндров с большим соотношением сторон (диаметр и длина).
Рис. 7. Компонента интенсивности магнитной индукции Bz вдоль оси Oz магнита; стандартные размеры магнита: черная линия 0,5 × 2 мм, синяя линия 2 × 2 мм, зеленая линия 3 × 2 мм, красная линия 5 × 2 мм.
Рисунок 8. Компонент магнитной индукции Br перпендикулярен оси магнита Oz; стандартный размер магнита: черная линия 0,5×2 мм, синяя линия 2×2 мм, зеленая линия 3×2 мм, красная линия 5×2 мм.
Рисунок 9. Компонент интенсивности магнитной индукции Bz на расстоянии r от оси конца магнита (z=0); стандартный размер магнита: черная линия 0,5×2 мм, синяя линия 2×2 мм, зеленая линия 3×2 мм, красная линия 5×2 мм.
Рисунок 10. Компонент магнитной индукции в радиальном направлении; стандартный размер магнита: черная линия 0,5×2 мм, синяя линия 2×2 мм, зеленая линия 3×2 мм, красная линия 5×2 мм.
Для изучения методов доставки МНП в опухолевые ткани, концентрации наночастиц в целевой области и определения поведения наночастиц в гидродинамических условиях в кровеносной системе можно использовать специальные гидродинамические модели. В качестве внешних магнитных полей можно использовать постоянные магниты. Если пренебречь магнитостатическим взаимодействием между наночастицами и не рассматривать модель магнитной жидкости, достаточно оценить взаимодействие между магнитом и отдельной наночастицей в диполь-дипольном приближении.
Где m — магнитный момент магнита, r — радиус-вектор точки, где расположена наночастица, а k — системный фактор. В дипольном приближении поле магнита имеет аналогичную конфигурацию (рис. 11).
В однородном магнитном поле наночастицы вращаются только вдоль силовых линий. В неоднородном магнитном поле на них действует сила:
Где — производная от заданного направления l. Кроме того, сила притягивает наночастицы в наиболее неровные области поля, то есть кривизна и плотность силовых линий увеличиваются.
Поэтому желательно использовать достаточно сильный магнит (или цепочку магнитов) с выраженной осевой анизотропией в области расположения частиц.
В таблице 1 показана способность одного магнита, являющегося достаточным источником магнитного поля, захватывать и удерживать магнитные наночастицы в сосудистом русле в зоне применения.