В настоящее время в вашем браузере отключен Javascript.Когда JavaScript отключен, некоторые функции этого сайта не будут работать.
Зарегистрируйте свои конкретные данные и конкретные интересующие вас лекарства, и мы сопоставим предоставленную вами информацию со статьями в нашей обширной базе данных и своевременно отправим вам копию в формате PDF по электронной почте.
Контролируйте движение магнитных наночастиц оксида железа для адресной доставки цитостатиков.
Автор Торопова Ю, Королев Д, Истомина М, Шульмейстер Г, Петухов А, Мишанин В, Горшков А, Подъячева Е, Гареев К, Багров А, Демидов О
Яна Торопова,1 Дмитрий Королев,1 Мария Истомина,1,2 Галина Шульмейстер,1 Алексей Петухов,1,3 Владимир Мишанин,1 Андрей Горшков,4 Екатерина Подьячева,1 Камиль Гареев,2 Алексей Багров,5 Олег Демидов6,71Национальный медицинский университет имени Алмазова Научный центр Минздрава России, Санкт-Петербург, 197341, Российская Федерация;2 Санкт-Петербургский электротехнический университет «ЛЭТИ», Санкт-Петербург, 197376, Российская Федерация;3 Центр персонализированной медицины ГБОУ ВПО «Государственный медицинский исследовательский центр имени Алмазова» Минздрава России, Санкт-Петербург, 197341, Российская Федерация;4ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России, Санкт-Петербург, Российская Федерация;5 Институт эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова РАН, Санкт-Петербург, Российская Федерация;6 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, 194064, Российская Федерация;7INSERM U1231, Медико-фармацевтический факультет, Университет Бургундии-Франш Конте, Дижон, Франция Связь: Яна Торопова Национальный медицинский исследовательский центр имени Алмазова Минздрава России, Санкт-Петербург, 197341, Российская Федерация Тел. +7 981 95264800 4997069 Эл. [email protected] Предыстория: Перспективным подходом к проблеме цитостатической токсичности является использование магнитных наночастиц (МНЧ) для адресной доставки лекарств.Цель: с помощью расчетов определить лучшие характеристики магнитного поля, контролирующего МНЧ in vivo, и оценить эффективность магнетронной доставки МНЧ к опухолям мышей in vitro и in vivo.(MNPs-ICG).Исследования интенсивности люминесценции in vivo проводились на опухолевых мышах с магнитным полем и без него в интересующем участке.Данные исследования проводились на гидродинамическом каркасе, разработанном Институтом экспериментальной медицины ФГБОУ ВО «Государственный медицинский исследовательский центр имени Алмазова» Минздрава России.Результат: Использование неодимовых магнитов способствовало избирательному накоплению МНЧ.Через минуту после введения MNPs-ICG мышам с опухолями MNPs-ICG в основном накапливается в печени.При отсутствии и наличии магнитного поля это указывает на путь его метаболизма.Хотя увеличение флуоресценции в опухоли наблюдалось в присутствии магнитного поля, интенсивность флуоресценции в печени животного не менялась с течением времени.Заключение: данный тип МНЧ в сочетании с расчетной напряженностью магнитного поля может стать основой для разработки магнитоконтролируемой доставки цитостатических препаратов к опухолевым тканям.Ключевые слова: флуоресцентный анализ, индоцианин, наночастицы оксида железа, магнетронная доставка цитостатиков, нацеливание на опухоль.
Опухолевые заболевания являются одной из основных причин смертности во всем мире.В то же время сохраняется динамика роста заболеваемости и смертности от опухолевых заболеваний.1 Используемая сегодня химиотерапия по-прежнему остается одним из основных методов лечения различных опухолей.В то же время разработка методов снижения системной токсичности цитостатиков по-прежнему актуальна.Перспективным методом решения проблемы ее токсичности является использование наноразмерных носителей для таргетных методов доставки лекарств, способных обеспечить локальное накопление лекарств в опухолевых тканях без увеличения их накопления в здоровых органах и тканях.концентрация.2 Этот метод позволяет повысить эффективность и направленность химиотерапевтических препаратов на опухолевые ткани, одновременно снижая их системную токсичность.
Среди различных наночастиц, рассматриваемых для адресной доставки цитостатиков, особый интерес представляют магнитные наночастицы (МНЧ) из-за их уникальных химических, биологических и магнитных свойств, которые обеспечивают их универсальность.Следовательно, магнитные наночастицы можно использовать в качестве системы нагрева для лечения опухолей с помощью гипертермии (магнитной гипертермии).Их также можно использовать в качестве диагностических средств (магнитно-резонансная диагностика).3-5 Использование этих характеристик в сочетании с возможностью накопления МНЧ в определенной области за счет использования внешнего магнитного поля для доставки таргетных фармацевтических препаратов открывает возможность создания многофункциональной магнетронной системы для нацеливания цитостатиков в очаг опухоли. Перспективы.Такая система будет включать MNP и магнитные поля для контроля их движения в организме.В качестве источника магнитного поля при этом могут использоваться как внешние магнитные поля, так и магнитные имплантаты, помещенные в участок тела, содержащий опухоль.6 Первый метод имеет серьезные недостатки, в том числе необходимость использования специализированного оборудования для магнитного нацеливания лекарств и необходимость обучения персонала для проведения хирургических операций.Кроме того, этот метод ограничен высокой стоимостью и подходит только для «поверхностных» опухолей, расположенных близко к поверхности тела.Альтернативный метод использования магнитных имплантатов расширяет сферу применения этой технологии, облегчая ее применение при опухолях, расположенных в разных частях тела.Как отдельные магниты, так и магниты, интегрированные во внутрипросветный стент, могут использоваться в качестве имплантатов при опухолевых повреждениях полых органов для обеспечения их проходимости.Однако, согласно нашим собственным неопубликованным исследованиям, они недостаточно магнитны, чтобы обеспечить удержание МНЧ из кровотока.
Эффективность магнетронной доставки лекарств зависит от многих факторов: характеристик самого магнитного носителя, характеристик источника магнитного поля (в том числе геометрических параметров постоянных магнитов и силы генерируемого ими магнитного поля).Разработка успешной технологии магнитоуправляемой доставки ингибиторов клеток должна включать разработку соответствующих магнитных наноразмерных носителей лекарств, оценку их безопасности и разработку протокола визуализации, позволяющего отслеживать их перемещения в организме.
В этом исследовании мы математически рассчитали оптимальные характеристики магнитного поля для управления магнитным наноразмерным переносчиком лекарств в организме.Возможность удержания МНЧ через стенку кровеносного сосуда под действием приложенного магнитного поля с указанными расчетными характеристиками была изучена также на изолированных кровеносных сосудах крыс.Кроме того, мы синтезировали конъюгаты МНЧ и флуоресцентных агентов и разработали протокол их визуализации in vivo.В условиях in vivo на опухолевых модельных мышах изучена эффективность накопления МНЧ в опухолевых тканях при системном введении под воздействием магнитного поля.
В исследовании in vitro мы использовали эталонный МНЧ, а в исследовании in vivo – МНЧ, покрытые полиэфиром молочной кислоты (полимолочная кислота, PLA), содержащим флуоресцентный агент (индолецианин; ICG).MNP-ICG включен в комплект поставки (MNP-PLA-EDA-ICG).
Синтез, а также физические и химические свойства МНЧ подробно описаны в других источниках.7,8
Для синтеза MNP-ICG сначала были получены конъюгаты PLA-ICG.Использовали порошкообразную рацемическую смесь ПЛА-Д и ПЛА-Л с молекулярной массой 60 кДа.
Поскольку PLA и ICG являются кислотами, для синтеза конъюгатов PLA-ICG сначала необходимо синтезировать спейсер с аминоконцевыми группами на PLA, который помогает ICG хемосорбироваться на спейсере.Спейсер синтезировали с использованием этилендиамина (EDA), карбодиимидного метода и водорастворимого карбодиимида, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDAC).Спейсер PLA-EDA синтезируют следующим образом.Добавьте 20-кратный молярный избыток EDA и 20-кратный молярный избыток EDAC к 2 мл 0,1 г/мл раствора PLA в хлороформе.Синтез проводили в полипропиленовой пробирке объемом 15 мл на шейкере при скорости 300 мин-1 в течение 2 часов.Схема синтеза представлена ​​на рисунке 1. Для оптимизации схемы синтеза повторите синтез с 200-кратным избытком реагентов.
По окончании синтеза раствор центрифугировали при скорости 3000 мин-1 в течение 5 минут для удаления избытка выпавших в осадок производных полиэтилена.Затем к 2 мл раствора добавляли 2 мл раствора ICG в диметилсульфоксиде (ДМСО) с концентрацией 0,5 мг/мл.Мешалку фиксируют при скорости перемешивания 300 мин-1 в течение 2 часов.Принципиальная схема полученного конъюгата представлена ​​на рисунке 2.
В 200 мг MNP мы добавили 4 мл конъюгата PLA-EDA-ICG.Перемешивают суспензию на шейкере ЛС-220 (ЛОИП, Россия) в течение 30 минут с частотой 300 мин-1.Затем его трижды промывали изопропанолом и подвергали магнитной сепарации.С помощью ультразвукового диспергатора УЗД-2 (ФГУП НИИ ТВЧ, Россия) вводить ИПА в суспензию в течение 5-10 минут под непрерывным ультразвуковым воздействием.После третьей промывки ИПС осадок промывали дистиллированной водой и ресуспендировали в физиологическом растворе в концентрации 2 мг/мл.
Для исследования распределения по размерам полученных МНЧ в водном растворе использовали оборудование ZetaSizer Ultra (Malvern Instruments, Великобритания).Для изучения формы и размера МНЧ использовали просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) с автоэмиссионным катодом JEM-1400 STEM (JEOL, Япония).
В данном исследовании мы используем цилиндрические постоянные магниты (класс N35; с никелевым защитным покрытием) следующих стандартных размеров (длина длинной оси × диаметр цилиндра): 0,5×2 мм, 2×2 мм, 3×2 мм и 5×2. мм.
Исследование in vitro транспорта МНЧ в модельной системе проводили на гидродинамическом каркасе, разработанном Институтом экспериментальной медицины ФГБОУ ВО ФГБОУ ВО «Государственный медицинский исследовательский центр имени Алмазова» Минздрава России.Объем циркулирующей жидкости (дистиллированная вода или раствор Кребса-Хензелейта) составляет 225 мл.В качестве постоянных магнитов используются аксиально намагниченные цилиндрические магниты.Поместите магнит на держатель на расстоянии 1,5 мм от внутренней стенки центральной стеклянной трубки так, чтобы его конец был обращен в сторону трубки (вертикально).Скорость потока жидкости в замкнутом контуре составляет 60 л/ч (что соответствует линейной скорости 0,225 м/с).Раствор Кребса-Хенселейта используется в качестве циркулирующей жидкости, поскольку он является аналогом плазмы.Коэффициент динамической вязкости плазмы составляет 1,1–1,3 мПа∙с.9 Количество МНЧ, адсорбированных в магнитном поле, определяют спектрофотометрически по концентрации железа в циркулирующей жидкости после эксперимента.
Кроме того, проведены экспериментальные исследования на усовершенствованном гидромеханическом столе для определения относительной проницаемости кровеносных сосудов.Основные компоненты гидродинамической опоры показаны на рисунке 3. Основными компонентами гидродинамического стента являются замкнутый контур, имитирующий поперечное сечение модели сосудистой системы, и резервуар для хранения.Движение модельной жидкости по контуру модуля кровеносных сосудов обеспечивается перистальтическим насосом.В ходе эксперимента поддерживайте режим испарения и необходимый температурный режим, контролируйте параметры системы (температуру, давление, скорость потока жидкости и значение pH).
Рис. 3. Блок-схема установки для исследования проницаемости стенки сонной артерии.1-накопитель, 2-перистальтический насос, 3-механизм введения суспензии, содержащей МНЧ, в контур, 4-расходомер, 5-датчик давления в контуре, 6-теплообменник, 7-камера с контейнером, 8-источник магнитного поля, 9-баллон с углеводородами.
Камера, содержащая контейнер, состоит из трех контейнеров: внешнего большого контейнера и двух малых контейнеров, через которые проходят рукава центрального контура.Канюлю вставляют в малый контейнер, контейнер нанизывают на малый контейнер и кончик канюли туго перевязывают тонкой проволокой.Пространство между большим контейнером и малым контейнером заполнено дистиллированной водой, а температура остается постоянной благодаря подключению к теплообменнику.Пространство в небольшом контейнере заполняется раствором Кребса-Хенселайта для поддержания жизнеспособности клеток кровеносных сосудов.Резервуар также заполнен раствором Кребса-Хензелайта.Система подачи газа (углерода) используется для испарения раствора в небольшом контейнере в резервуаре-хранилище и камере, содержащей контейнер (рис. 4).
Рисунок 4. Камера, в которой находится контейнер.1- Канюля для опускания сосудов, 2- Наружная камера, 3- Малая камера.Стрелка указывает направление модельной жидкости.
Для определения показателя относительной проницаемости сосудистой стенки использовали сонную артерию крысы.
Введение в систему суспензии МНП (0,5 мл) имеет следующие характеристики: общий внутренний объем резервуара и соединительной трубки в контуре составляет 20 мл, внутренний объем каждой камеры - 120 мл.Источник внешнего магнитного поля представляет собой постоянный магнит типоразмером 2×3 мм.Его устанавливают над одной из малых камер на расстоянии 1 см от контейнера, обращенным одним концом к стенке контейнера.Температура поддерживается на уровне 37°С.Мощность роликового насоса установлена ​​на 50%, что соответствует скорости 17 см/с.В качестве контроля образцы отбирали в ячейке без постоянных магнитов.
Через час после введения заданной концентрации МНЧ из камеры отбирали пробу жидкости.Концентрацию частиц измеряли спектрофотометром с использованием UV-Vis спектрофотометра Unico 2802S (United Products & Instruments, США).Учитывая спектр поглощения суспензии МНЧ, измерение проводили при 450 нм.
Согласно рекомендациям Рус-ЛАСА-ФЕЛАСА, все животные выращиваются и выращиваются в специальных, свободных от патогенов условиях.Это исследование соответствует всем применимым этическим нормам для экспериментов и исследований на животных и получило этическое одобрение Национального медицинского исследовательского центра имени Алмазова (IACUC).Животные пили воду вволю и регулярно кормились.
Исследование проведено на 10 наркотизированных 12-недельных самцах мышей NSG с иммунодефицитом (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Jackson Laboratory, США) 10 массой 22 г ± 10%.Поскольку иммунитет мышей с иммунодефицитом подавлен, мышам с иммунодефицитом этой линии разрешена трансплантация человеческих клеток и тканей без отторжения трансплантата.Однопометники из разных клеток были случайным образом распределены в экспериментальную группу, и их скрещивали совместно или систематически подвергали воздействию подстилки других групп, чтобы обеспечить равное воздействие общей микробиоты.
Линия раковых клеток человека HeLa используется для создания модели ксенотрансплантата.Клетки культивировали в среде DMEM, содержащей глютамин («ПанЭко», Россия), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки («Hyclone», США), пенициллина 100 КОЕ/мл и стрептомицина 100 мкг/мл.Линия клеток любезно предоставлена ​​Лабораторией регуляции экспрессии генов Института клеточных исследований РАН.Перед инъекцией клетки HeLa удаляли из культурального пластика раствором трипсин:Версен (1:1) («Биолот», Россия).После промывания клетки суспендировали в полной среде до концентрации 5×106 клеток на 200 мкл и разводили матрицей базальной мембраны (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, на льду).Приготовленную клеточную суспензию вводили подкожно в кожу бедра мыши.Используйте электронные штангенциркули для мониторинга роста опухоли каждые 3 дня.
Когда объем опухоли достигал 500 мм3, в мышечную ткань экспериментального животного вблизи опухоли имплантировали постоянный магнит.В экспериментальной группе (МНЧ-ИКГ + опухоль-М) вводили 0,1 мл суспензии МНЧ и подвергали воздействию магнитного поля.В качестве контроля (фон) использовали необработанных цельных животных.Кроме того, использовали животных, которым вводили 0,1 мл МНЧ, но не имплантировали магниты (МНЧ-ИКГ + опухоль-БМ).
Флуоресцентную визуализацию образцов in vivo и in vitro осуществляли на биоимиджере IVIS Lumina LT series III (PerkinElmer Inc., США).Для визуализации in vitro в лунки планшета добавляли 1 мл синтетического конъюгата PLA-EDA-ICG и MNP-PLA-EDA-ICG.С учетом характеристик флуоресценции красителя ИЦГ выбирается лучший фильтр, используемый для определения силы света образца: максимальная длина волны возбуждения составляет 745 нм, а длина волны излучения - 815 нм.Программное обеспечение Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) использовали для количественного измерения интенсивности флуоресценции лунок, содержащих конъюгат.
Интенсивность флуоресценции и накопление конъюгата MNP-PLA-EDA-ICG измеряли на мышах с моделью опухоли in vivo без присутствия и приложения магнитного поля в интересующем участке.Мышей анестезировали изофлураном, а затем через хвостовую вену вводили 0,1 мл конъюгата MNP-PLA-EDA-ICG.Необработанных мышей использовали в качестве отрицательного контроля для получения флуоресцентного фона.После внутривенного введения конъюгата поместите животное на нагревательную ступень (37°C) в камере флуоресцентного томографа IVIS Lumina LT серии III (PerkinElmer Inc.), поддерживая при этом ингаляцию с 2% анестезией изофлураном.Используйте встроенный фильтр ICG (745–815 нм) для обнаружения сигнала через 1 минуту и ​​15 минут после введения MNP.
Для оценки накопления конъюгата в опухоли область брюшины животного покрывали бумагой, что позволяло исключить яркую флюоресценцию, связанную с накоплением частиц в печени.После изучения биораспределения MNP-PLA-EDA-ICG животных гуманно умерщвляли путем передозировки изофлуранового наркоза для последующего разделения опухолевых участков и количественной оценки флуоресцентного излучения.Используйте программное обеспечение Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.), чтобы вручную обработать анализ сигнала из выбранной интересующей области.Для каждого животного было проведено по три измерения (n = 9).
В этом исследовании мы не оценивали количественно успешную нагрузку ICG на MNP-ICG.Кроме того, мы не сравнивали эффективность удержания наночастиц под воздействием постоянных магнитов разной формы.Кроме того, мы не оценивали долговременное влияние магнитного поля на удержание наночастиц в опухолевых тканях.
Преобладают наночастицы со средним размером 195,4 нм.Кроме того, суспензия содержала агломераты со средним размером 1176,0 нм (рис. 5А).Впоследствии порцию фильтровали через центробежный фильтр.Дзета-потенциал частиц составляет -15,69 мВ (рис. 5Б).
Рисунок 5. Физические свойства суспензии: (А) распределение частиц по размерам;(B) распределение частиц при дзета-потенциале;(C) ПЭМ-фотография наночастиц.
Размер частиц в основном составляет 200 нм (рис. 5C), они состоят из одного MNP размером 20 нм и сопряженной органической оболочки PLA-EDA-ICG с более низкой электронной плотностью.Образование агломератов в водных растворах можно объяснить относительно низким модулем электродвижущей силы отдельных наночастиц.
Для постоянных магнитов, когда намагниченность сосредоточена в объеме V, интегральное выражение разбивается на два интеграла, а именно объем и поверхность:
В случае образца с постоянной намагниченностью плотность тока равна нулю.Тогда выражение вектора магнитной индукции примет следующий вид:
Для численного расчета использовать программу MATLAB (MathWorks, Inc., США), академическая лицензия ЛЭТИ № 40502181.
Как показано на Рисунок 7 Рисунок 8 Рисунок 9 Рисунок-10, самое сильное магнитное поле создается магнитом, ориентированным в осевом направлении от конца цилиндра.Эффективный радиус действия эквивалентен геометрии магнита.В цилиндрических магнитах с цилиндром, длина которого превышает его диаметр, наиболее сильное магнитное поле наблюдается в аксиально-радиальном направлении (для соответствующего компонента);поэтому пара цилиндров с большим удлинением (диаметром и длиной) адсорбции МНЧ является наиболее эффективной.
Рис. 7. Составляющая напряженности магнитной индукции Bz вдоль оси Oz магнита;стандартный размер магнита: черная линия 0,5х2мм, синяя линия 2х2мм, зеленая линия 3х2мм, красная линия 5х2мм.
Рис. 8. Компонента магнитной индукции Br перпендикулярна оси магнита Oz;стандартный размер магнита: черная линия 0,5х2мм, синяя линия 2х2мм, зеленая линия 3х2мм, красная линия 5х2мм.
Рис. 9. Компонента напряженности магнитной индукции Bz на расстоянии r от торцевой оси магнита (z=0);стандартный размер магнита: черная линия 0,5х2мм, синяя линия 2х2мм, зеленая линия 3х2мм, красная линия 5х2мм.
Рис. 10. Составляющая магнитной индукции в радиальном направлении;стандартный размер магнита: черная линия 0,5×2 мм, синяя линия 2×2 мм, зеленая линия 3×2 мм, красная линия 5×2 мм.
С помощью специальных гидродинамических моделей можно изучить способ доставки МНЧ к опухолевым тканям, концентрировать наночастицы в целевой области и определить поведение наночастиц в гидродинамических условиях в системе кровообращения.В качестве внешних магнитных полей можно использовать постоянные магниты.Если пренебречь магнитостатическим взаимодействием между наночастицами и не рассматривать модель магнитной жидкости, то достаточно оценить взаимодействие магнита с одиночной наночастицей в диполь-дипольном приближении.
Где m — магнитный момент магнита, r — радиус-вектор точки, в которой находится наночастица, а k — системный коэффициент.В дипольном приближении поле магнита имеет аналогичную конфигурацию (рис. 11).
В однородном магнитном поле наночастицы вращаются только вдоль силовых линий.В неоднородном магнитном поле на него действует сила:
Где – производная данного направления l.Кроме того, сила втягивает наночастицы в самые неровные участки поля, то есть увеличивается кривизна и плотность силовых линий.
Поэтому желательно использовать достаточно сильный магнит (или магнитную цепочку) с явной аксиальной анизотропией в зоне расположения частиц.
В таблице 1 показана способность одного магнита как достаточного источника магнитного поля захватывать и удерживать МНЧ в сосудистом русле области применения.